Во вселенной стратегической компьютерной игры StarCraft внеземная раса зергов примечательна тем, что научилась усваивать генетический материал других организмов и преобразовывать собственные гены, меняясь и адаптируясь к новым условиям. Эта, на первый взгляд, фантастическая идея намного ближе к реальным возможностям живых организмов, чем кажется.
Сегодня мы очень много знаем про ДНК: этой двухцепочечной молекуле посвящено более двух миллионов научных публикаций. Молекулу ДНК можно рассмотреть как текст, написанный с использованием алфавита из четырех букв (нуклеотидов). Совокупность всех нуклеотидов, составляющих хромосомы любого организма, называется геномом. Геном человека насчитывает примерно три миллиарда «букв».
Отдельные участки генома представляют собой обособленные гены - функциональные элементы, которые чаще всего отвечают за синтез конкретных белков. У человека около 20 000 кодирующих белки генов. Белки, как и молекулы ДНК, являются полимерами, но состоят не из нуклеотидов, а из аминокислот. «Алфавит» аминокислот, входящих в состав белков, насчитывает 20 молекул. Зная нуклеотидную последовательность гена, можно точно определить аминокислотную последовательность белка, который он кодирует. Дело в том, что все организмы используют один и тот же (с небольшими вариациями) хорошо изученный генетический код - правила соответствия кодонов (троек нуклеотидов) определенным аминокислотам. Подобная универсальность позволяет генам из одного организма работать в другом организме и при этом производить тот же самый белок.
Естественная инженерия
Один из основных методов генной инженерии растений использует агробактерии и разработанный ими механизм модификации растительных геномов (см. «ПМ» № 10"2005). Гены обитающих в почве агробактерий кодируют специальные белки, способные «протащить» определенную молекулу ДНК в растительную клетку, встроить ее в растительный геном и тем самым заставить растение производить нужные для бактерии питательные вещества. Ученые позаимствовали эту идею и нашли ей применение, заменив нужные бактериям гены на те, которые кодируют белки, необходимые в сельском хозяйстве. Например, Bt-токсины, которые производят почвенные бактерии Bacillus thuringiensis , абсолютно безопасные для млекопитающих и ядовитые для некоторых насекомых, или белки, придающие растению устойчивость к конкретному гербициду.
Обмен генами для бактерий, даже не родственных, - очень распространенное явление. Именно из-за этого микробы, устойчивые к пенициллину, появились уже через несколько лет после начала его массового применения, а в наши дни проблема устойчивости к антибиотикам стала одной из самых тревожных в медицине.
От вирусов к организмам
Естественной «генной инженерией» занимаются не только бактерии, но и вирусы. В геномах многих организмов, включая человека, есть транспозоны - бывшие вирусы, которые давно встроились в ДНК хозяина и, как правило, не принося ему вреда, могут «перескакивать» с одного места в геноме на другое.
Ретровирусы (такие как ВИЧ) умеют встраивать свой генетический материал прямо в геном эукариотических клеток (например, клеток человека). Аденовирусы не встраивают свою генетическую информацию в геномы животных и растений: их гены могут включаться и работать без этого. Эти и другие вирусы активно используются в генной терапии для лечения целого спектра наследственных заболеваний.
Таким образом, естественная генная инженерия очень широко используется в природе и играет огромную роль в адаптации организмов к окружающей среде. Еще важнее то, что все живые организмы постоянно подвергаются генетическим изменениям в результате случайных мутаций. Из этого следует важный вывод: по сути, каждый организм (если не считать клонов) является уникальным и генетически модифицированным по сравнению со своими предками. У него есть как новые мутации, так и новые комбинации существовавших ранее вариантов генов - в геноме любого ребенка обнаруживаются десятки генетических вариантов, которых не было ни у одного из родителей. Кроме возникновения новых мутаций, в ходе полового размножения в каждом поколении возникает новая комбинация уже существующих у родителей генетических вариантов.
Проверено в опытах
Сегодня активно обсуждается безопасность пищевых продуктов, содержащих генетически модифицированные организмы (ГМО). Для продуктов генной инженерии, осуществляемой человеком, намного лучше подходит термин «генетически модернизированные организмы», так как генная инженерия позволяет ускорить те процессы генетических изменений, которые самостоятельно происходят в природе, и направить их в нужное человеку русло. Однако между механизмами генетической модернизации и природными процессами генетической модификации нет никаких существенных различий, поэтому вполне обоснованно можно считать, что производство ГМ-продуктов питания не несет дополнительных рисков.
Однако, как и любая научная гипотеза, безопасность ГМО нуждалась в экспериментальной проверке. Вопреки многочисленным утверждениям противников ГМО, этот вопрос очень и очень тщательно исследуется не первый десяток лет. В этом году в журнале Critical reviews in biotechnology был опубликован обзор почти 1800 научных работ, посвященных изучению безопасности ГМО за последние десять лет. Лишь в трех исследованиях возникли подозрения о негативном влиянии трех конкретных ГМ-сортов, но эти подозрения не оправдались, еще в двух случаях была установлена потенциальная аллергенность ГМ-сортов. Единственный подтвержденный случай касался гена бразильского ореха, встраиваемого в ГМ-сорт сои. Стандартная в таких случаях проверка реакции сыворотки крови людей, страдающих аллергией, на белок нового ГМ-сорта, показала существование опасности, и разработчики отказались от продвижения сорта на рынок.
Кроме того, стоит отдельно упомянуть обзор 2012 года, опубликованный в журнале Food and Chemical Toxicology , в который вошло 12 исследований безопасности употребления ГМО в пищу на нескольких (от двух до пяти) поколениях животных и еще 12 исследований на животных долгосрочного (от трех месяцев до двух лет) потребления ГМО в пищу. Авторы обзора пришли к выводу об отсутствии каких-либо негативных эффектов ГМО (по сравнению с немодернизированными аналогами).
Скандальные разоблачения
Вокруг некоторых работ, якобы показывающих вред отдельных ГМ-сортов растений, возникают курьезы. Типичный пример, который очень любят приводить противники ГМО, - это нашумевшая публикация французского исследователя Сералини в журнале Food and Chemical Toxicology , который утверждал, что ГМ-кукуруза вызывает рак и увеличение смертности крыс. В научной среде работа Сералини вызвала бурные дискуссии, но не потому, что исследователь получил и опубликовал какие-то уникальные данные. Причиной было то, что с научной точки зрения работа была выполнена крайне небрежно и содержала грубые ошибки, заметные с первого взгляда.
Тем не менее представленные Сералини фотографии крыс с крупными опухолями произвели огромное впечатление на общественность. Несмотря на то что его статья не выдержала объективной критики и была отозвана из журнала, ее продолжают цитировать противники ГМО, которых научная сторона вопроса явно не интересует, а фотографии больных крыс до сих пор показывают с экранов.
Научный уровень обсуждения потенциальной опасности ГМО в СМИ и в обществе в целом поражает наивностью. На прилавках магазинов можно встретить крахмал, соль и даже воду «без ГМО». ГМО постоянно путают с консервантами, пестицидами, синтетическими удобрениями и пищевыми добавками, к которым генная инженерия не имеет прямого отношения. От реальных проблем безопасности питания подобные дискуссии уводят в область спекуляций и подмены понятий.
Опасности - настоящие и нет
Впрочем, ни эта статья, ни другие научные работы не пытаются доказать, что ГМО «абсолютно безопасны». На самом деле ни один продукт питания не является абсолютно безопасным, ведь еще Парацельс сказал знаменитую фразу: «Всё есть яд, и ничто не лишено ядовитости; одна лишь доза делает яд незаметным». Даже обычная картошка может вызывать аллергию, а позеленевшая содержит токсичные алкалоиды - соланины.
Может ли как-то измениться работа уже имеющихся генов растения в результате встраивания нового гена? Да, может, но от изменений в работе генов не застрахован ни один организм. Может ли в результате генной инженерии появиться новый сорт растения, который распространится за пределы сельскохозяйственных угодий и как-то повлияет на экосистему? Теоретически и такое возможно, но и это происходит в природе повсеместно: появляются новые виды, экосистемы меняются, одни виды вымирают, другие занимают их место. Однако нет оснований полагать, что генная инженерия несет в себе дополнительные риски для окружающей среды или для здоровья людей или животных. Но про эти риски постоянно трубят в СМИ. Почему?
Рынок ГМО в значительной степени монополизирован. Среди гигантов на первом месте стоит компания Monsanto. Разумеется, крупные производители ГМ-семян и технологий заинтересованы в прибыли, у них есть собственные интересы и собственное лобби. Но они зарабатывают деньги не «из воздуха», а предлагая человечеству прогрессивные сельскохозяйственные технологии, за которые производители голосуют самым убедительным образом - долларом, песо, юанем и т. д.
Основные производители и поставщики «органических» продуктов, выращенных с использованием устаревших технологий и, следовательно, более дорогих (но не более качественных) - тоже вовсе не мелкие фермеры, а такие же крупные компании с многомиллиардными оборотами. Только в США рынок органических продуктов составил в 2012 году $31 млрд. Это серьезный бизнес, и, поскольку органик-продукты не имеют каких-либо преимуществ перед ГМО, но обходятся дороже в производстве, рыночными методами конкурировать с ГМ-сортами они не могут. Вот и приходится посредством СМИ внушать доверчивым потребителям ничем не обоснованный страх перед мифическими «генами скорпиона», который и рождает спрос на дорогие и нетехнологичные «органик-продукты». Кроме того, противники ГМО, описывающие страшные опасности генно-модифицированных сортов, вырабатывающих белок B. thuringiensis , обычно забывают упомянуть о том, что препараты на основе таких культур или выделенных из них белков в «органическом земледелии» разрешены (и широко применяются). Как и натуральный навоз, который может оказаться источником кучи патогенных бактерий и прочей натуральной гадости.
Немного политики
Сегодня генная инженерия - одна из наиболее изученных с точки зрения безопасности технологий. Она позволяет создавать более качественные продукты питания, уменьшить количество используемых на полях пестицидов и защитить окружающую среду (да, именно защитить: на полях, засеянных Bt-сортами, живет больше насекомых и птиц, чем на «обычных», которые приходится регулярно обрабатывать инсектицидами).
Но существует и еще одна причина «борьбы» с ГМО - исключительно политическая. Страны, значительно отставшие в сфере биотехнологий, пытаются найти повод не допустить более дешевые продукты из других стран на свой рынок. Впрочем, такая защита отечественных производителей от иностранной продукции имеет смысл только в том случае, если помогает выиграть время, чтобы развить собственные технологии до конкурентоспособного состояния. Если же этого не делать, есть серьезный риск отстать от мирового научного и технологического уровня. Навсегда.
«Редакторы геномов». От «цинковых пальцев» до CRISPR
Появление методов манипулирования генетическим материалом ознаменовало собой настоящую революцию в биологии, биотехнологии и медицине. Направленное вмешательство в геном живых организмов позволило решать широкий спектр задач, начиная от создания модифицированных видов бактерий, растений и животных, обладающих новыми ценными свойствами, и клеточных моделей, необходимых для создания новых лекарств, до разработки методов генотерапии, открывающей перспективы исправления врожденных генетических нарушений
Но чтобы успешно вторгаться в «святая святых» клетки – ее наследственный материал, необходимы технологии, позволяющие расщеплять и соединять молекулы ДНК в заданных участках. Поистине революционный прорыв в этой области произошел всего несколько лет назад, когда на основе механизмов «бактериального иммунитета» был разработан простой метод генетической инженерии CRISPR/Cas, обеспечивающий точное воздействие на заданные участки ДНК. Этот метод открыл принципиально новые возможности для манипуляций на уровне генома высших организмов, позволяя вносить точечные мутации, исправлять, встраивать или удалять фрагменты и даже целые гены.
Чтобы успешно вторгаться в «святая святых» клетки – ее наследственный материал, необходимы технологии, позволяющие расщеплять и соединять молекулы ДНК в заданных участках.
Для этих целей можно использовать рестриктазы – ферменты, способные узнавать определенные короткие нуклеотидные последовательности и расщеплять по ним молекулу ДНК. Для соединения нуклеотидных фрагментов используют ферменты ДНК-лигазы, которые входят в состав природных ферментных комплексов, исправляющих (репарирующих) повреждения в структуре ДНК. «Сшивку» ДНК можно осуществлять также ферментными комплексами системы рекомбинации, благодаря которой происходит обмен гомологичных фрагментов в составе геномных ДНК в процессе образования половых клеток.
Открытие ферментов рестрикции и ДНК-лигаз в 1960-1970-х гг. стало толчком к появлению генетической инженерии: с помощью этих ферментов оказалось возможным расщеплять ДНК на заданные фрагменты и вновь соединять их, формируя новые генетические конструкции. Так получали (и получают сейчас) различные варианты бактериальных и вирусных геномов.
Однако с помощью такого набора инструментов оказалось крайне трудно манипулировать большими сложными геномами высших организмов. Проблема заключалась в том, что ферменты рестрикции могут «узнавать» только относительно короткие последовательности ДНК. Такой специфичности вполне достаточно для работы с короткими ДНК вирусов и бактерий, поскольку в пределах той же бактериальной ДНК конкретные короткие нуклеотидные последовательности встречаются не слишком часто. Поэтому практически всегда можно подобрать рестриктазу, которая расщепит бактериальную ДНК на достаточно небольшой набор фрагментов, из которых можно затем выбрать нужные. Если повезет, то можно будет даже подобрать фермент, который расщепит ДНК в одном, точно определенном месте.
Но специфичности рестриктаз совершенно недостаточно для работы с геномами растений и животных. Такие геномы содержат множество коротких последовательностей нуклеотидов, которые узнаются рестриктазами, поэтому направленное воздействие на один определенный участок становится невозможным. Между тем для решения большого числа важнейших задач биотехнологии и фундаментальной медицины требовались эффективные и точные инструменты для осуществления точечного воздействия на определенные участки ДНК в составах геномов высших организмов, в том числе человека.
Сначала были химеры
Первые попытки создания методов редактирования сложных геномов связаны с конструированием «искусственных ферментов» в виде олигонуклеотидов (коротких нуклеотидных последовательностей), которые могли бы избирательно связываться с определенными последовательностями в структуре целевой ДНК и несли бы на себе химические группы, способные расщеплять ДНК (Кнорре, Власов, 1985). Однако до сих пор эффективных методов расщепления ДНК на такой основе создать не удалось.
Реально работающим подходом оказалось конструирование химерных нуклеаз – сложных белков, содержащих две структурные единицы, одна из которых катализирует расщепление ДНК, а вторая способна избирательно связываться с определенными нуклеотидными последовательностями в составе целевой молекулы, направляя на этот участок действие нуклеазы. Подобные химерные нуклеазы можно «производить» непосредственно в клетке: для этого в нее вносят соответствующие генно-инженерные конструкции (векторы), кодирующие нуклеазы. Такие векторы снабжаются сигналом ядерной локализации – белковой структурой, обеспечивающей поступление конструкции в ядро клетки к геномной ДНК.
Первыми среди химерных нуклеаз стали zinc-finger нуклеазы, в состав которых в качестве адресующих структур входят так называемые «цинковые пальцы». Последние представляют собой белковые домены (достаточно стабильные и независимые элементы третичной структуры белка), содержащие молекулу цинка и по форме действительно напоминающие палец (Kim et al. , 1996). Каждый «цинковый палец» способен «узнать» и специфично связаться с определенной последовательностью ДНК из трех нуклеотидов.
Нужно сказать, что домены «цинковые пальцы» встречаются в составе человеческих факторов транскрипции – белков, регулирующих процесс синтеза РНК с матрицей ДНК. При создании искусственных нуклеаз можно сконструировать цепочку из «цинковых пальцев» так, что она будет узнавать определенный участок ДНК. Если такая цепочка будет достаточно длинной, она может распознавать относительно протяженные последовательности ДНК, состоящие из ряда тринуклеотидных фрагментов. Это означает реальную возможность точечного воздействия на заданные участки в составе больших сложных геномов.
Однако у метода «цинковых пальцев» обнаружились и серьезные недостатки: во-первых, это не вполне строгое распознавание тринуклеотидных повторов, что приводит к заметному числу расщеплений ДНК в «нецелевых» участках. Во-вторых, метод оказался весьма трудозатратным и дорогостоящим, поскольку для каждой последовательности ДНК необходимо создать свою оптимизированную белковую структуру zinc-finger нуклеазы. Поэтому система «цинковые пальцы» широкого распространения не получила.
Поскольку механизм «узнавания» ДНК в данном случае однозначен и прост (один нуклеотид распознается одним белковым доменом), то получение конструкции, специфично распознающей нужную исследователю нуклеотидную последовательность, – относительно простая задача. Соединяя такую направляющую конструкцию с ферментом, расщепляющим ДНК (как правило, для этих целей используется FokI – каталитический домен фермента рестрикции), мы получаем систему с высокой специфичностью действия.
Здесь нужно отметить, что для успешного разрезания молекулы ДНК с помощью FokI необходимо две субъединицы этого фермента. Поэтому все химерные нуклеазы, в составе которых имеется FokI, работают парами: каждая из них узнает свой специфический участок на разных цепочках молекулы ДНК. Эти целевые сайты выбираются так, чтобы они находились на небольшом (10-20 нуклеотидов) расстоянии, достаточном для димеризации доменов FokI, в результате которой формируется каталитически активная структура. Поскольку каждый из блоков такой бинарной нуклеазы связывается с ДНК независимо, точность расщепления ДНК повышается, а воздействие на «нецелевые» последовательности минимизируется.
Бактериальное ноу-хау
С помощью искусственных нуклеаз TALENs оказалось теоретически возможным внести двунитевой разрыв в любой участок генома. В 2011 г. методы геномной инженерии, в первую очередь использование TALENs, были названы авторитетным журналом «Nature Methods» «методом года» благодаря колоссальному спектру возможных применений в самых разных областях фундаментальной и прикладной науки, от функциональной геномики и биологии развития до сельскохозяйственной биотехнологии.
Однако в 2012-2013 гг. в этой области произошел поистине революционный прорыв: был разработан новый метод генетической инженерии CRISPR/Cas, открывший принципиально новые возможности для манипуляций на уровне генома высших организмов (Cong et al. , 2013). Этот метод чрезвычайно прост, обеспечивает точное воздействие на заданные участки ДНК и может быть использован практически в любой современной молекулярно-биологической лаборатории.
В отличие от химерных нуклеаз, в CRISPR/Cas структурами, узнающими ДНК, являются не белки, а короткие РНК. Идея создания такой системы родилась при изучении механизмов, которые бактерии используют для защиты от своих патогенных вирусов (бактериофагов). Конкретно речь идет о своеобразных «иммунных» реакциях бактерий на проникновение определенного бактериофага, которая выражается в избирательном расщеплении его геномной ДНК.
Работа этого механизма обеспечивается специальными участками бактериального генома – CRISPR локусами (от Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). Как видно по названию, этот локус состоит из стандартных повторенных некодирующих последовательностей бактериальной ДНК, а разделяют эти повторы спейсеры – короткие фрагменты чужеродной (вирусной или плазмидной) ДНК. Последние встраиваются в бактериальный геном после того, как ДНК бактериофага, попавшего в клетку бактерии, рекомбинирует с ее геномом. Состав и порядок расположения спейсеров указывает на число «атак» различных вирусов, успешно пережитых самой бактериальной клеткой и (или) ее родительскими поколениями.
Как это работает? При повторном проникновении в бактериальную клетку уже «известного» ей вируса происходит синтез протяженной первичной РНК, закодированной в CRISPR-локусе. В результате «созревания» этой первичной ДНК образуется ряд коротких фрагментов (crRNA), каждый из которых состоит из специфического участка, соответствующего спейсеру, и универсальных участков, соответствующих палиндромным повторам бактериальной ДНК. Бактериальная ДНК отвечает за привлечение уже упоминавшихся Cas-белков, а спейсер играет роль наводчика: он связывается с определенным, комплементарным ему участком вирусной ДНК, после чего белки Cas разрезают ее, обеспечивая уничтожение бактериофага. Благодаря своей высокой специфичности и способности к быстрой «настройке» система CRISPR/Cas работает очень эффективно, обеспечивая бактерии и ее потомству надежную защиту от патогенов.
К настоящему времени детально описаны несколько типов защитных систем CRISPR, функционирующих в клетках различных бактерий. Наиболее «популярной» оказалась система CRISPR/Cas типа II-А, обнаруженная у бактерии Streptococcus pyogenes , которая состоит из трех генов, кодирующих crRNA, трансактивирующую РНК (tracrRNA) и белок Cas9. На основе этой системы и были созданы универсальные генетические конструкции, кодирующие элементы искусственного «редактора генома» CRISPR/Cas.
Был создан и упрощенный вариант системы, функционирующей в виде комплекса из белка Cas9 и единой направляющей РНК, состоящей из трансактивирующей CRISPR РНК и короткой «зрелой» crRNA. Направляющая последовательность опознает целевой участок ДНК и комплементарно связывается с ним, а Сas9 – разрезает ДНК в нужном месте.
С помощью системы CRISPR/Cas можно осуществлять все виды модификаций генома: вносить точечные мутации, встраивать в определенные места новые гены либо, наоборот, удалять крупные участки нуклеотидных последовательностей, исправлять или заменять отдельные генетические элементы и фрагменты генов.
Технологически стратегия геномной инженерии с помощью системы CRISPR/Cas включает в себя следующие этапы: выбор целевой последовательности и определение вида необходимого воздействия; создание ген-направленной конструкции и доставка ее в клеточное ядро; анализ участка генома, подвергнутого воздействию.
Система CRISPR может быть использована для получения как генетически модифицированных клеток, выращиваемых в культуре, так и живых организмов. В первом случае в клетки вводят плазмиды или вирусные векторы, которые обеспечивают высокий и устойчивый синтез элементов системы CRISPR/Cas. Во втором случае в одноклеточные эмбрионы животных путем микроинъекции вводят уже «готовые» crRNA и мРНК, с которой происходит синтез белка Cas9. Для получения генетически модифицированных растений, клетки которых имеют прочную оболочку, используют выращиваемые в культуре протопласты (растительные клетки без внешней оболочки) и плазмиды, кодирующие элементы CRISPR/Cas. Другой подход, применяемый для растений, – использование агробактерий, природных «генных инженеров», несущих специальную плазмиду.
Настоящее и будущее
Благодаря своей простоте, эффективности и широким возможностям система CRISPR/Cas за короткое время уже нашла применение в самых различных областях фундаментальной и прикладной биологии, биотехнологии и медицины.
Внося модификации в различные элементы генома клеток животных и растений и изучая последствия, ученые получают возможность исследовать роль отдельных генов в функционировании отдельных клеток и всего организма в целом. С помощью системы CRISPR/Cas уже получен ряд мутантных лабораторных животных (мышей, крыс, лягушек, рыб). Все эти модельные организмы открывают новые перспективы для исследований в области биологии развития, иммунологии и изучения заболеваний человека и животных.
Уникальная способность комплекса системы CRISPR/Cas избирательно связываться с определенными участками ДНК позволила разработать на ее основе регуляторы активности генов. Для этого в систему включают каталитически неактивный мутантный белок Cas9, к которому могут быть присоединены белки, активирующие или подавляющие функции промоторов, управляющих работой генов. При связывании такого комплекса с целевой ДНК может подавляться либо стимулироваться работа целевого гена.
Более того, при использовании системы CRISPR/Cas возможно одновременно вводить в клетки несколько генетических конструкций, направленных на разные участки генома. Это позволяет воздействовать на работу одновременно нескольких генов, чтобы исследовать взаимоотношения между ними и их участие в нормальных и патологических процессах жизнедеятельности. Таким способом можно, например, определить мутации в генах, ответственные за развитие устойчивости раковых опухолей к химиотерапии.
Одной из важнейших задач современной биомедицины является создание клеточных моделей для поиска и доклинического исследования новых лекарств. Внося направленные модификации в геном стволовых клеток человека, мы получаем линии клеток-моделей наследственных заболеваний, вызванных нарушениями функций определенных генов. Такие клеточные линии являются, по сути, неограниченным источником «пациентов в пробирке», на которых можно проводить тестирование десятков тысяч различных химических соединений – потенциальных лекарств.
Большие надежды на CRISPR/Cas возлагаются и в связи с развитием генотерапии. Несмотря на многолетние широкие исследования, до настоящего времени не удалось разработать приемлемых методов введения в клетки генов, замещающих дефектные. Главная причина неудач – применение генетических конструкций, содержащих «лишнюю» ДНК (бактериальную или вирусную), к тому же встраивались они неуправляемо, в произвольные участки генома. Все это приводило к различным нарушениям работы генетического аппарата, в том числе к злокачественному перерождению клеток. Однако CRISPR/Cas позволяет вводить гены в геном с хирургической точностью, что делает генотерапию безопасной.
Более того, с помощью этого метода можно не вводить извне «чужие», но редактировать собственный генетический аппарат, сохраняя «свои» системы регуляции. Так уже удалось отредактировать аномальный ген в стволовых клетках пациента, страдающего муковисцидозом (Schwank et al. , 2013). Такие клетки с «отремонтированным» геномом могут быть трансплантированы обратно в организм больного, где они заменят больные клетки и восполнят утраченную ими функцию.
К важнейшим задачам современной биотехнологии и биомедицины, нуждающихся в развитии технологий редактирования геномов, относятся:создание растений и животных, обладающих новыми, ценными свойствами и признаками (урожайность, устойчивость к неблагоприятным условиям среды, вредителям и патогенам);
получение мутантных модельных животных для исследования заболеваний человека;
разработка методов генотерапии, исправления генетических мутаций в культивируемых стволовых клетках человека;
создание клеточных моделей для поиска и доклинического исследования новых лекарств
Применение метода CRISPR/Cas в комбинации с клеточными технологиями открывает принципиальную возможность радикального избавления людей от генетических заболеваний, таких как сахарный диабет, хорея Хантингтона, мышечные дистрофии и др. Генетическое вмешательство может быть осуществлено на уровне эмбрионов, получаемых при проведении экстракорпорального оплодотворения, из которых можно вырастить организм, все клетки которого будут иметь модифицированный геном. Препятствием на пути развития таких технологий являются только этические проблемы: вся необходимая техника уже существует и опробована на лабораторных животных. Например, удалось вырастить здоровых мышей из эмбриональных клеток, в которых был скорректирован дефектный ген, ответственный за развитие катаракты. Эти особи дали здоровое потомство (Wu et al. , 2013).
Современные средства терапии, к сожалению, не способны воздействовать на вирусную ДНК, находящуюся в составе человеческой ДНК. Системы, функционирующие по механизму CRISPR, возможно, позволят в будущем радикально излечивать подобные хронические заболевания, вызываемые вирусами, встраивающимися в геном человека (вирусами гепатита В, герпеса, ВИЧ и др.). Так, известен случай излечения от СПИДа так называемого «берлинского пациента» Т. Брауна в результате пересадки ему стволовых клеток крови от донора, несущего мутацию «невосприимчивости» к ВИЧ. С помощью технологии CRISPR/Cas возможно внести мутацию в этот ген в клетках, которые могут быть затем трансплантированы в организм зараженного.
Одной из важнейших задач современной биотехнологии является создание новых пород скота, а также сельскохозяйственных культур растений, высокоурожайных и устойчивых к неблагоприятным условиям. Главной целью применения метода CRISPR/Cas в биотехнологии является создание генетически модифицированных животных и посевных растений, которые бы обладали новыми ценными свойствами. С помощью этой системы уже внесены точные модификации в геном пшеницы и табака, получены сорта риса, устойчивые к бактериям Xanthomonas , вызывающие бактериальную гниль, которая наносит большой экономический ущерб сельскому хозяйству (Chen, Gao, 2013).
Еще одним интересным биотехнологическим направлением применения системы CRISPR/Cas является получение линий животных или растений, способных синтезировать белки человека, например, инсулин, необходимый больным сахарным диабетом, или альбумин, использующийся при лечении геморрагического шока, ожогов и цирроза печени. Сейчас альбумин получают из плазмы крови человека – весьма ограниченного источника, однако мировая потребность в этом препарате постоянно растет и сегодня составляет 500 т в год. С помощью методов геномной инженерии ген альбумина человека уже введен в геном риса и крупного рогатого скота (He et al. , 2011; Moghaddassi et al. , 2014). Такой белок может быть выделен из растительных и животных тканей, где он синтезировался, и после очищения использован для медицинских целей.
Несомненно, в ближайшее время система CRISPR/Cas будет усовершенствована: можно ожидать упрощения белкового каталитического компонента, повышения избирательности действия системы, создания более эффективных средств доставки в разные типы клеток и целые организмы. Уже получены данные, указывающие на то, что на основе системы CRISPR можно создать средства направленного воздействия не только на ДНК, но и на РНК, что откроет новые возможности для регуляции активности генов и борьбы с вирусными инфекциями.
Хотя система редактирования геномов CRISPR/Cas была создана лишь в 2012 г., она уже применяется во многих лабораториях и компаниях развитых стран. Опубликованы сотни результатов исследований с применением этой технологии, описаны десятки успешных экспериментов по редактированию геномов дрожжей, грызунов, насекомых, растений и человеческих клеток.
Компоненты системы в виде готовых наборов производятся компанией «Life Technologies», недавно слившейся с компанией «Thermo Fisher» (США), и доступны для исследователей. Крупнейшие фармацевтические фирмы, такие как «Takeda», формируют с помощью технологии CRISPR банки генетически модифицированных стволовых клеток – клеточных моделей заболеваний.
Несмотря на активное применение этой технологии в крупных мировых научных центрах, в России CRISPR/Cas используют лишь в нескольких исследовательских центрах, в том числе в Новосибирском Академгородке. Сегодня технологии TALENs и CRISPR/Cas используют в лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, лаборатории молекулярной и клеточной медицины Института патологии кровообращения им. академика Е. Н. Мешалкина и в лаборатории стволовых клеток Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в работах, связанных с внесением мутаций в стволовые клетки человека, в частности, для создания клеточных моделей бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, Паркинсона и синдрома удлиненного интервала QT.
Однако для проведения полномасштабных исследовательских работ с использованием TALENs и CRISPR/Cas необходимо создание консорциума по клеточным технологиям с привлечением ведущих специалистов на базе профильных НИИ РАМН: кардиологии, иммунологии, неврологии, онкологии и др. Создание в Новосибирском Академгородке Центра клеточных технологий может стать инфраструктурной основой для развития новых биомедицинских технологий и высокотехнологичной фармацевтической промышленности – приоритетных направлений развития научно-технического потенциала страны.
В настоящее время в разработке находится проект Биобанка клеточных моделей заболеваний человека, основой которого станут линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из обычных соматических клеток людей, страдающих различными наследственными и приобретенными заболеваниями. Кроме того, в Биобанк войдут клеточные модели наследственных заболеваний человека – клеточные линии, полученные с помощью методов геномной инженерии TALENs и CRISPR/Cas.
Клеточные линии и культуры будут храниться в жидком азоте, – в таком состоянии они могут оставаться жизнеспособными в течение десятилетий и использоваться по мере необходимости. Все хранящиеся в биобанке клеточные культуры и линии будут детально охарактеризованы: для каждой будет составлен «паспорт», содержащий сведения о ее происхождении и характеристиках. Такие клеточные линии могут быть предоставлены в распоряжение как академических институтов для проведения фундаментальных исследований по изучению механизмов развития болезней, так и частным компаниям, занимающимся поиском, разработкой, производством и тестированием новых лекарств.
Литература
Власов В. В. и др. Комплементарные здоровью. Прошлое, настоящее и будущее антисмысловых технологий // НАУКА из первых рук. 2014. № 1 (55). С. 38-50.
Кнорре Д. Г., Власов В. В. // Успехи химии. 1985. T. 54, № 9. С.1420-1447.
Медведев С. П. Как отредактировать наследственность // НАУКА из первых рук. 2014, № 1 (55). С. 10-14.
Сong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. 2013, V. 339.
P. 819-823.
Kim Y.G., Cha J., Chandrasegaran, S. (1996). Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 1156-1160.
Moghaddassi S., Eyestone W., Bishop C.E. (2014). TALEN-mediated modification of the bovine genome for large-scale production of human serum albumin. PLoS One 9, e89631.
Schwank, G., Koo, B.K., Sasselli, V. et al. (2013). Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell 13, 653-658.
Wu, Y., Liang, D., Wang, Y., Bai, M. et al. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell 13, 659-662.
Полимерия - взаимодействие неаллельных множественных генов, однонаправленно влияющих на развитие одного и того же признака; степень проявления признака зависит от количества генов. Полимерные гены обозначаются одинаковыми буквами, а аллели одного локуса имеют одинаковый нижний индекс.
Полимерное взаимодействие неаллельных генов может быть кумулятивным и некумулятивным. При кумулятивной (накопительной) полимерии степень проявления признака зависит от суммарного действия нескольких генов. Чем больше доминантных алле¬лей генов, тем сильнее выражен тот или иной признак. Расщепле¬ние в F2 по фенотипу при дигибридном скрещивании происходит в соотношении 1:4:6:4:1, а в целом соответствует третьей, пятой (при дигибридном скрещивании), седьмой (при тригибридном скрещивании) и т.п. строчкам в треугольнике Паскаля.
При некумулятивной полимерии признак проявляется при наличии хотя бы одного из доминантных аллелей полимерных генов. Количество доминантных аллелей не влияет на степень выраженности признака. Расщепление в F2 по фенотипу при дигибридном скрещивании - 15:1.
Пример полимерии - наследование цвета кожи у людей, который зависит (в первом приближении) от четырёх генов с кумулятивным эффектом.
Ген-модификатор
Ген,
не имеющий собственного выражения в
фенотипе, но оказывающий усиливающее
или ослабляющее влияние на экспрессию
др. генов (соответственно, ген-интенсификатор
20.Хромосомная теория и история ее создания.
21.Механизмы наследования пола. Влияние факторов внутреней и внешней среды на развитие признаков пола.
22. Наследование признаков сцепленных с полом.
У всех двуполых организмов имеются два типа хромосом. Первый тип – аутосомы (неполовые хромосомы). Они одинаковы у организмов женского и мужского пола. Второй тип – половые хромосомы, по ним имеются различия организмов по полу: у женских особей 2 одинаковые хромосомы XX, у мужских XY. Такой тип пола называется гомогаметным. Характерен для млекопитающих, рыб, насекомых. Второй тип пола – гетерогаметный, самки XY, самцы XX. Половые хромосомы различаются по своим размерам. У большинства организмов в X – хромосоме находиться много генов, в Y – хромосоме локализованы единичные гены. Только у рыб Y – хромосома относительно богаче генами. Если гены локализованы в X – хромосоме, а Y – хромосома генетически интерна, то такой тип наследования признаков называется наследованием, сцепленным с полом. Если гены представлены только в одной хромосоме, а вторая генетически интерна, то такие организмы называются генизиготными.
23. Сцепленное наследование и кроссинговер
Поскольку у большинства организмов имеется много (несколько тысяч) генов, а хромосом - ограниченное число, то в одной хромосоме располагается одновременно несколько генов. Гены, входящие в состав одной хромосомы, называются сцепленными и образуют группу сцепления. Наследуются они как единое целое, т. к. это определяется поведением хромосомы в мейозе. В таком случае расщепление по сцепленным признакам не подчиняется закону независимого наследования. Если гены расположены близко друг к другу, то они всегда сохраняются в исходных сочетаниях.
Например, АВ/аb х аb/аb -> 1 Аb/аb: 1 аb/аb.
Это случай так называемого полного сцепления, которое наблюдается нечасто. Гораздо более распространенными являются ситуации, когда гены располагаются на некотором удалении друг от друга. В таком случае частичного сцепления они могут разделяться в результате процесса, называющегося кроссинговером. Это еще один вид генетической рекомбинации. Кроссинговер осуществляется в профазе первого мейотического деления в момент конъюгации хромосом. В это время хроматиды гомологичных хромосом обмениваются фрагментами наследственного материала, в результате чего появляются новые комбинации генов.
К примеру, АВ/аb х аb/аb → АВ/аb: аb/аb: Аb/аb: аВ
Численность рекомбинантных (или кроссоверных) классов всегда меньше, чем нерекомбинантных, и соотношение двух классов внутри каждой группы всегда равно 1:1. Величина кроссинговера, вычисляемая как процентное отношение рекомбинантов к общей численности потомства, является показателем расстояния между генами и используется для картирования хромосом - расположения генов на карте хромосомы в строго определенном порядке и на фиксированных расстояниях. Эти расстояния обладают свойством аддитивности, которое заключается в следующем. Если имеется три гена, расположенных в порядке А-В-С, то АС = АВ + ВС. Такая аддитивность однозначно свидетельствует о линейности расположения генов в хромосомах.
Если рассматривается кроссинговер между большим числом генов, то получается картина гораздо более сложная - отдельные акты кроссинговера взаимодействуют друг с другом. Такое взаимное влияние актов кроссинговера называется интерференцией.
